Javascript सध्या तुमच्या ब्राउझरमध्ये अक्षम आहे.जावास्क्रिप्ट अक्षम केल्यावर, या वेबसाइटची काही कार्ये कार्य करणार नाहीत.
जेवियर फिडाल्गो, * पियरे-अँटोइन डेगलेस्ने, * रॉड्रिगो अॅरोयो, * लिलियन सेप्युल्वेडा, * इव्हगेनिया रान्नेवा, फिलीप डेप्रेझ विज्ञान विभाग, स्किन टेक फार्मा ग्रुप, कॅस्टेलो डी'एम्पुरीज, कॅटालोनिया, स्पेन * या लेखकांना या कामाबद्दल काही अंतर्दृष्टी आहे. योगदान पार्श्वभूमी: Hyaluronic acid (HA) हे नैसर्गिकरित्या उद्भवणारे पॉलिसेकेराइड आहे जे सौंदर्याच्या उद्देशाने डर्मल फिलरच्या उत्पादनात वापरले जाते.मानवी ऊतींमध्ये अनेक दिवसांचे अर्धे आयुष्य असल्याने, HA-आधारित डर्मल फिलर्स शरीरात त्यांचे आयुष्य वाढवण्यासाठी रासायनिकरित्या सुधारित केले जातात.व्यावसायिक HA-आधारित फिलर्समध्ये सर्वात सामान्य बदल म्हणजे 1,4-ब्युटेनेडिओल डिग्लिसिडिल इथर (BDDE) चा वापर HA साखळ्यांना क्रॉसलिंक करण्यासाठी क्रॉसलिंकिंग एजंट म्हणून केला जातो.अवशिष्ट किंवा प्रतिक्रिया न केलेले BDDE <2 भाग प्रति दशलक्ष (ppm) वर गैर-विषारी मानले जाते;म्हणून, रुग्णाची सुरक्षितता सुनिश्चित करण्यासाठी अंतिम डर्मल फिलरमधील अवशिष्ट बीडीडीईचे प्रमाण निश्चित करणे आवश्यक आहे.साहित्य आणि पद्धती: हा अभ्यास द्रव क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) एकत्र करून अल्कधर्मी परिस्थितीत BDDE आणि HA मधील क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियेच्या उप-उत्पादनाचे शोध आणि वैशिष्ट्य वर्णन करतो.परिणाम: वेगवेगळ्या विश्लेषणांनंतर, असे आढळून आले की HA-BDDE हायड्रोजेल निर्जंतुक करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या अल्कधर्मी परिस्थिती आणि उच्च तापमानामुळे हे नवीन उप-उत्पादन, "प्रोपिलीन ग्लायकोल-समान" कंपाऊंड तयार होण्यास प्रोत्साहन मिळाले.LC-MS विश्लेषणाने पुष्टी केली की उप-उत्पादनामध्ये BDDE प्रमाणेच मोनोइसोटोपिक वस्तुमान आहे, भिन्न धारणा वेळ (tR), आणि भिन्न UV शोषक (λ=200 nm) मोड आहे.BDDE च्या विपरीत, LC-MS विश्लेषणामध्ये असे आढळून आले की समान मापन परिस्थितीत, या उप-उत्पादनाचा शोध दर 200 nm वर जास्त आहे.निष्कर्ष: हे परिणाम सूचित करतात की या नवीन कंपाऊंडच्या संरचनेत इपॉक्साइड नाही.व्यावसायिक कारणांसाठी HA-BDDE हायड्रोजेल (HA dermal filler) च्या उत्पादनात सापडलेल्या या नवीन उप-उत्पादनाच्या जोखमीचे मूल्यांकन करण्यासाठी चर्चा खुली आहे.कीवर्ड: hyaluronic acid, HA dermal filler, cross-linked hyaluronic acid, BDDE, LC-MS विश्लेषण, BDDE उप-उत्पादन.
हायलुरोनिक ऍसिड (HA) वर आधारित फिलर हे कॉस्मेटिक हेतूंसाठी वापरले जाणारे सर्वात सामान्य आणि लोकप्रिय डर्मल फिलर आहेत.1 हे त्वचीय फिलर एक हायड्रोजेल आहे, सामान्यतः > 95% पाणी आणि 0.5-3% HA, जे त्यांना जेलसारखी रचना देते.2 HA हे पॉलिसेकेराइड आहे आणि कशेरुकांच्या बाह्य पेशी मॅट्रिक्सचा मुख्य घटक आहे.घटकांपैकी एक.त्यात (1,4)-ग्लुक्युरोनिक ऍसिड-β (1,3)-N-एसिटिलग्लुकोसामाइन (GlcNAc) पुनरावृत्ती होणारी डिसॅकराइड युनिट्स ग्लायकोसिडिक बॉण्ड्सने जोडलेली असतात.हा डिसॅकराइड पॅटर्न सर्व जीवांमध्ये सारखाच असतो.काही प्रथिने-आधारित फिलर्स (जसे की कोलेजन) च्या तुलनेत, हा गुणधर्म HA ला अत्यंत जैव सुसंगत रेणू बनवतो.हे फिलर्स रुग्णाच्या रोगप्रतिकारक प्रणालीद्वारे ओळखल्या जाणार्‍या अमीनो ऍसिड अनुक्रमाची विशिष्टता प्रदर्शित करू शकतात.
डर्मल फिलर म्हणून वापरल्यास, HA ची मुख्य मर्यादा म्हणजे हायलुरोनिडेसेस नावाच्या एन्झाईम्सच्या विशिष्ट कुटुंबाच्या उपस्थितीमुळे ऊतींमधील जलद उलाढाल.आतापर्यंत, ऊतींमधील HA चे अर्धे आयुष्य वाढवण्यासाठी HA संरचनेत अनेक रासायनिक बदलांचे वर्णन केले गेले आहे.3 यातील बहुतेक बदल HA साखळ्यांना क्रॉस-लिंक करून पॉलिसेकेराइड पॉलिमरमध्ये हायलुरोनिडेसचा प्रवेश कमी करण्याचा प्रयत्न करतात.त्यामुळे, HA संरचना आणि क्रॉस-लिंकिंग एजंट दरम्यान पूल आणि आंतर-आण्विक सहसंयोजक बंध तयार झाल्यामुळे, क्रॉस-लिंक केलेले HA हायड्रोजेल नैसर्गिक HA पेक्षा जास्त एन्झाईम डिग्रेडेशन उत्पादने तयार करते.4-6
आत्तापर्यंत, क्रॉसलिंक केलेले HA तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या रासायनिक क्रॉसलिंकिंग एजंट्समध्ये मेथॅक्रिलामाइड, 7 हायड्रॅझाइड, 8 कार्बोडाइमाइड, 9 डिव्हिनिल सल्फोन, 1,4-ब्युटानेडिओल डिग्लिसिडिल इथर (BDDE) आणि पॉली (इथिलीन ग्लायकॉल) डायग्लिसिडिल इथर यांचा समावेश होतो.10,11 BDDE सध्या सर्वात जास्त वापरले जाणारे क्रॉसलिंकिंग एजंट आहे.जरी या प्रकारचे हायड्रोजेल दशकांपासून सुरक्षित असल्याचे सिद्ध झाले असले तरी, क्रॉसलिंकिंग एजंट वापरलेले प्रतिक्रियाशील अभिकर्मक आहेत जे सायटोटॉक्सिक आणि काही प्रकरणांमध्ये, म्युटेजेनिक असू शकतात.12 म्हणून, अंतिम हायड्रोजेलमध्ये त्यांची अवशिष्ट सामग्री जास्त असणे आवश्यक आहे.जेव्हा अवशिष्ट एकाग्रता 2 भाग प्रति दशलक्ष (ppm) पेक्षा कमी असते तेव्हा BDDE सुरक्षित मानले जाते.4
कमी-अवशेष बीडीडीई एकाग्रता, क्रॉस-लिंकिंग डिग्री आणि एचए हायड्रोजेलमधील प्रतिस्थापन स्थिती शोधण्यासाठी अनेक पद्धती आहेत, जसे की गॅस क्रोमॅटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), न्यूक्लियर मॅग्नेटिक रेझोनान्स (एनएमआर) फ्लूरोसेन्स मापन पद्धती, आणि डायोड अॅरे कपल्ड हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (HPLC).13-17 हा अभ्यास अल्कधर्मी परिस्थितीत BDDE आणि HA च्या प्रतिक्रियेद्वारे उत्पादित अंतिम क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेलमधील उप-उत्पादनाचे शोध आणि वैशिष्ट्य वर्णन करतो.एचपीएलसी आणि लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस विश्लेषण).BDDE च्या या उप-उत्पादनाची विषाक्तता अज्ञात असल्याने, आम्ही शिफारस करतो की त्याचे अवशेष प्रमाणीकरण अंतिम उत्पादनामध्ये सामान्यतः BDDE वर केलेल्या पद्धतीप्रमाणेच निर्धारित केले जावे.
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) च्या मिळवलेल्या सोडियम मीठाचे आण्विक वजन ~1,368,000 Da (लॉरेंट पद्धत) 18 आहे आणि आंतरिक स्निग्धता 2.20 m3/kg आहे.क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियेसाठी, BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) कडून खरेदी केले गेले.pH 7.4 सह फॉस्फेट बफर केलेले सलाईन सिग्मा-अल्ड्रिच कंपनीकडून खरेदी केले गेले.एलसी-एमएस विश्लेषणात वापरलेले सर्व सॉल्व्हेंट्स, एसीटोनिट्रिल आणि पाणी HPLC ग्रेड गुणवत्तेवरून खरेदी केले गेले.फॉर्मिक ऍसिड (98%) अभिकर्मक ग्रेड म्हणून खरेदी केले जाते.
सर्व प्रयोग UPLC ऍक्विटी सिस्टीमवर (वॉटर्स, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) केले गेले आणि ते एपीआय 3000 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटरला इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) ने जोडले गेले.
1% अल्कली (सोडियम हायड्रॉक्साईड, NaOH) च्या उपस्थितीत 10% (w/w) सोडियम hyaluronate (NaHA) द्रावणात 198 mg BDDE जोडून क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेलचे संश्लेषण सुरू करण्यात आले.प्रतिक्रिया मिश्रणातील अंतिम BDDE एकाग्रता 9.9 mg/mL (0.049 mM) होती.त्यानंतर, प्रतिक्रिया मिश्रण पूर्णपणे मिसळले आणि एकसंध केले गेले आणि 4 तासांसाठी 45°C वर पुढे जाऊ दिले.19 प्रतिक्रियेचा pH ~12 वर राखला जातो.
त्यानंतर, प्रतिक्रिया मिश्रण पाण्याने धुतले गेले आणि अंतिम HA-BDDE हायड्रोजेल 10 ते 25 mg/mL ची HA एकाग्रता आणि 7.4 चे अंतिम pH प्राप्त करण्यासाठी PBS बफरने फिल्टर आणि पातळ केले गेले.उत्पादित क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेल निर्जंतुक करण्यासाठी, हे सर्व हायड्रोजेल ऑटोक्लेव्ह केले जातात (20 मिनिटांसाठी 120°C).शुद्ध BDDE-HA हायड्रोजेल विश्लेषण होईपर्यंत 4°C वर साठवले जाते.
क्रॉस-लिंक केलेल्या HA उत्पादनामध्ये उपस्थित असलेल्या BDDE चे विश्लेषण करण्यासाठी, 240 mg नमुना वजन करून मध्यभागी (Microcon®; Merck Millipor, Billerica, MA, USA; व्हॉल्यूम 0.5 mL) मध्ये आणला गेला आणि खोलीच्या तापमानाला 10,000 rpm वर केंद्रीत केले गेले. 10 मिनिटे.एकूण 20 μL पुल-डाउन द्रव गोळा करून त्याचे विश्लेषण करण्यात आले.
BDDE मानक (Sigma-Aldrich Co) चे क्षारीय परिस्थितीत (1%, 0.1% आणि 0.01% NaOH) विश्लेषण करण्यासाठी, खालील अटी पूर्ण झाल्यास, द्रव नमुना 1:10, 1:100 किंवा पर्यंत 1:1,000,000 आवश्यक असल्यास, विश्लेषणासाठी MilliQ डिआयोनाइज्ड पाणी वापरा.
क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया (HA 2%, H2O, 1% NaOH, आणि 0.049 mM BDDE) मध्ये वापरल्या जाणार्‍या प्रारंभिक सामग्रीसाठी, या सामग्रीपासून तयार केलेल्या प्रत्येक नमुन्याचे 1 mL समान विश्लेषण परिस्थिती वापरून विश्लेषण केले गेले.
आयन नकाशामध्ये दिसणार्‍या शिखरांची विशिष्टता निश्चित करण्यासाठी, 100 ppb BDDE मानक द्रावणाचे 10 μL (Sigma-Aldrich Co) 20 μL नमुन्यात जोडले गेले.या प्रकरणात, प्रत्येक नमुन्यातील मानकांची अंतिम एकाग्रता 37 पीपीबी आहे.
प्रथम, 10 μL मानक BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ पाण्यात (घनता 1.1 g/mL) पातळ करून 11,000 mg/L (11,000 ppm) च्या एकाग्रतेसह BDDE स्टॉक सोल्यूशन तयार करा.हे द्रावण 110 µg/L (110 ppb) BDDE द्रावण इंटरमीडिएट स्टँडर्ड डायल्युशन म्हणून तयार करण्यासाठी वापरा.त्यानंतर, 75, 50, 25, 10, आणि 1 ppb ची इच्छित एकाग्रता प्राप्त करण्यासाठी इंटरमीडिएट डायल्युएंट अनेक वेळा पातळ करून मानक वक्र तयार करण्यासाठी इंटरमीडिएट BDDE स्टँडर्ड डायल्युएंट (110 ppb) वापरा.आकृती 1 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, 1.1 ते 110 ppb मधील BDDE मानक वक्र चांगले रेखीयता (R2>0.99) असल्याचे आढळले आहे.मानक वक्र चार स्वतंत्र प्रयोगांमध्ये पुनरावृत्ती होते.
आकृती 1 LC-MS विश्लेषणाद्वारे प्राप्त केलेला BDDE मानक कॅलिब्रेशन वक्र, ज्यामध्ये चांगला सहसंबंध दिसून येतो (R2>0.99).
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री.
क्रॉस-लिंक्ड HA आणि बेस सोल्युशनमधील BDDE मानके ओळखण्यासाठी आणि BDDE मानके ओळखण्यासाठी, LC-MS विश्लेषण वापरले गेले.
क्रोमॅटोग्राफिक पृथक्करण LUNA 2.5 µm C18(2)-HST स्तंभ (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) वर साध्य केले गेले आणि विश्लेषणादरम्यान खोलीच्या तापमानात (25°C) ठेवले गेले.मोबाइल फेजमध्ये एसीटोनिट्रिल (विद्रावक A) आणि पाणी (विद्रावक बी) 0.1% फॉर्मिक ऍसिड असते.मोबाइल फेज ग्रेडियंट इल्युशनद्वारे इल्युट केला जातो.ग्रेडियंट खालीलप्रमाणे आहे: 0 मिनिटे, 2% ए;1 मिनिट, 2% ए;6 मिनिटे, 98% ए;7 मिनिटे, 98% ए;7.1 मिनिटे, 2% ए;10 मिनिटे, 2% A. चालण्याची वेळ 10 मिनिटे आहे आणि इंजेक्शनची मात्रा 20 μL आहे.BDDE ची धारणा वेळ सुमारे 3.48 मिनिटे आहे (प्रयोगांवर आधारित 3.43 ते 4.14 मिनिटांपर्यंत).LC-MS विश्लेषणासाठी मोबाईल फेज 0.25 mL/min च्या प्रवाह दराने पंप करण्यात आला.
MS द्वारे BDDE विश्लेषण आणि प्रमाणीकरणासाठी, UPLC प्रणाली (वॉटर) एका API 3000 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (AB SCIEX) सह इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्त्रोताने सुसज्ज आहे, आणि विश्लेषण सकारात्मक आयन मोड (ESI+) मध्ये केले जाते.
BDDE वर केलेल्या आयन फ्रॅगमेंट विश्लेषणानुसार, सर्वाधिक तीव्रतेचा तुकडा 129.1 Da (आकृती 6) शी संबंधित तुकडा असल्याचे निर्धारित केले गेले.म्हणून, प्रमाणीकरणासाठी मल्टी-आयन मॉनिटरिंग मोड (MIM) मध्ये, BDDE चे वस्तुमान रूपांतरण (मास-टू-चार्ज रेशो [m/z]) 203.3/129.1 Da आहे.हे LC-MS विश्लेषणासाठी पूर्ण स्कॅन (FS) मोड आणि उत्पादन आयन स्कॅन (PIS) मोड देखील वापरते.
पद्धतीची विशिष्टता सत्यापित करण्यासाठी, रिक्त नमुना (प्रारंभिक मोबाइल टप्पा) चे विश्लेषण केले गेले.रिक्त नमुन्यात 203.3/129.1 Da च्या वस्तुमान रूपांतरणासह कोणताही सिग्नल आढळला नाही.प्रयोगाच्या पुनरावृत्तीच्या संदर्भात, 55 ppb (कॅलिब्रेशन वक्रच्या मध्यभागी) च्या 10 मानक इंजेक्शन्सचे विश्लेषण केले गेले, परिणामी अवशिष्ट मानक विचलन (RSD) <5% (डेटा दर्शविला नाही).
चार स्वतंत्र प्रयोगांशी संबंधित आठ वेगवेगळ्या ऑटोक्लेव्हड बीडीडीई क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेलमध्ये अवशिष्ट BDDE सामग्रीचे प्रमाण निश्चित केले गेले."सामग्री आणि पद्धती" विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रमाणीकरणाचे मूल्यमापन बीडीडीई मानक विघटनाच्या प्रतिगमन वक्रच्या सरासरी मूल्याद्वारे केले जाते, जे 203.3/129.1 Da च्या BDDE वस्तुमान संक्रमणामध्ये आढळलेल्या अद्वितीय शिखराशी संबंधित आहे, एक धारणा वेळ 3.43 ते 4.14 मिनिटे प्रतीक्षा नाही.आकृती 2 10 ppb BDDE संदर्भ मानकाचे उदाहरण क्रोमॅटोग्राम दाखवते.तक्ता 1 आठ वेगवेगळ्या हायड्रोजेलच्या अवशिष्ट BDDE सामग्रीचा सारांश देते.मूल्य श्रेणी 1 ते 2.46 ppb आहे.म्हणून, नमुन्यातील अवशिष्ट BDDE एकाग्रता मानवी वापरासाठी (<2 ppm) स्वीकार्य आहे.
आकृती 2 10 ppb BDDE संदर्भ मानक (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) संक्रमण 203.30/129.10 Da (सकारात्मक MRM मोडमध्ये) च्या LC-MS विश्लेषणाद्वारे प्राप्त झालेले आयन क्रोमॅटोग्राम.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण;एमएस, वस्तुमान;m/z, वस्तुमान-ते-चार्ज गुणोत्तर.
टीप: नमुने 1-8 ऑटोक्लेव्ह केलेले BDDE क्रॉस-लिंक HA हायड्रोजेल आहेत.हायड्रोजेलमधील बीडीडीईचे अवशिष्ट प्रमाण आणि बीडीडीई टिकवून ठेवण्याची कमाल वेळ देखील नोंदवली जाते.शेवटी, वेगवेगळ्या धारणा वेळेसह नवीन शिखरांचे अस्तित्व देखील नोंदवले जाते.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;HA, hyaluronic ऍसिड;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण;टीआर, धारणा वेळ;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;RRT, सापेक्ष धारणा वेळ.
आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, LC-MS आयन क्रोमॅटोग्रामच्या विश्लेषणात असे दिसून आले की विश्लेषण केलेल्या सर्व ऑटोक्लेव्ह क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेल नमुन्यांच्या आधारावर, 2.73 ते 3.29 मिनिटांच्या लहान धारणा वेळेत अतिरिक्त शिखर होते.उदाहरणार्थ, आकृती 3 क्रॉस-लिंक केलेल्या HA नमुन्याचे आयन क्रोमॅटोग्राम दर्शविते, जेथे अतिरिक्त शिखर अंदाजे 2.71 मिनिटांच्या वेगळ्या धारणा वेळेवर दिसते.नव्याने निरीक्षण केलेले शिखर आणि BDDE मधील शिखर यांच्यातील निरीक्षण सापेक्ष धारणा वेळ (RRT) 0.79 (टेबल 1) असल्याचे आढळले.LC-MS विश्लेषणामध्ये वापरल्या जाणार्‍या C18 स्तंभामध्ये नव्याने पाहिलेले शिखर कमी राखले गेले आहे हे आम्हाला माहीत असल्याने, नवीन शिखर BDDE पेक्षा अधिक ध्रुवीय संयुगाशी संबंधित असू शकते.
आकृती 3 LC-MS (MRM वस्तुमान रूपांतरण 203.3/129.0 Da) द्वारे प्राप्त क्रॉस-लिंक केलेल्या HA हायड्रोजेल नमुन्याचे आयन क्रोमॅटोग्राम.
संक्षेप: HA, hyaluronic ऍसिड;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण;आरआरटी, सापेक्ष धारणा वेळ;tR, धारणा वेळ.
वापरलेल्या कच्च्या मालामध्ये आढळून आलेली नवीन शिखरे मूळतः दूषित असू शकतात ही शक्यता नाकारण्यासाठी, या कच्च्या मालाचे विश्लेषण देखील त्याच LC-MS विश्लेषण पद्धतीद्वारे केले गेले.विश्लेषण केलेल्या प्रारंभिक सामग्रीमध्ये पाणी, 2% NaHA पाण्यात, 1% NaOH पाण्यात, आणि क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियेमध्ये वापरल्या जाणार्‍या समान एकाग्रतेवर BDDE यांचा समावेश होतो.वापरलेल्या प्रारंभिक सामग्रीच्या आयन क्रोमॅटोग्राममध्ये कोणतेही संयुग किंवा शिखर दिसून आले नाही आणि त्याची धारणा वेळ निरीक्षण केलेल्या नवीन शिखराशी संबंधित आहे.ही वस्तुस्थिती ही कल्पना नाकारते की केवळ प्रारंभिक सामग्रीमध्ये कोणतेही संयुगे किंवा पदार्थ असू शकतात जे विश्लेषण प्रक्रियेत व्यत्यय आणू शकतात, परंतु इतर प्रयोगशाळा उत्पादनांसह संभाव्य क्रॉस-दूषित होण्याची चिन्हे नाहीत.BDDE आणि नवीन शिखरांच्या LC-MS विश्लेषणानंतर प्राप्त झालेली एकाग्रता मूल्ये तक्ता 2 (नमुने 1-4) आणि आकृती 4 मधील आयन क्रोमॅटोग्राममध्ये दर्शविली आहेत.
टीप: नमुने 1-4 ऑटोक्लेव्ह्ड BDDE क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेल तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या कच्च्या मालाशी संबंधित आहेत.हे नमुने ऑटोक्लेव्ह केलेले नव्हते.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;HA, hyaluronic ऍसिड;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण.
आकृती 4 HA आणि BDDE च्या क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियेमध्ये वापरलेल्या कच्च्या मालाच्या नमुन्याच्या LC-MS क्रोमॅटोग्रामशी संबंधित आहे.
टीप: हे सर्व क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया पार पाडण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या समान एकाग्रता आणि गुणोत्तराने मोजले जातात.क्रोमॅटोग्रामद्वारे विश्लेषित केलेल्या कच्च्या मालाच्या संख्येशी संबंधित आहेत: (1) पाणी, (2) 2% HA जलीय द्रावण, (3) 1% NaOH जलीय द्रावण.LC-MS विश्लेषण 203.30/129.10 Da (सकारात्मक MRM मोडमध्ये) च्या वस्तुमान रूपांतरणासाठी केले जाते.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;HA, hyaluronic ऍसिड;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण.
नवीन शिखरांच्या निर्मितीस कारणीभूत असलेल्या परिस्थितीचा अभ्यास केला गेला.क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेल तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या प्रतिक्रिया परिस्थितीचा BDDE क्रॉस-लिंकिंग एजंटच्या प्रतिक्रियाशीलतेवर कसा परिणाम होतो, याचा अभ्यास करण्यासाठी, नवीन शिखरे (शक्य उप-उत्पादने) तयार होतात, भिन्न मापन केले गेले.या निर्धारांमध्ये, आम्ही अंतिम BDDE क्रॉसलिंकरचा अभ्यास केला आणि त्याचे विश्लेषण केले, ज्यावर जलीय माध्यमात NaOH (0%, 1%, 0.1%, आणि 0.01%) च्या वेगवेगळ्या एकाग्रतेसह उपचार केले गेले, त्यानंतर ऑटोक्लेव्हिंग किंवा त्याशिवाय.समान परिस्थितीचे अनुकरण करण्यासाठी जीवाणू प्रक्रिया क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेल तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या पद्धतीप्रमाणेच आहे."सामग्री आणि पद्धती" विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे, नमुन्याचे वस्तुमान संक्रमण LC-MS द्वारे 203.30/129.10 Da वर विश्लेषण केले गेले.BDDE आणि नवीन शिखराची एकाग्रता मोजली गेली आहे, आणि परिणाम तक्ता 3 मध्ये दर्शविले आहेत. सोल्युशनमध्ये NaOH च्या उपस्थितीकडे दुर्लक्ष करून, ऑटोक्लेव्ह न केलेल्या नमुन्यांमध्ये कोणतेही नवीन शिखर आढळले नाहीत (नमुने 1-4, तक्ता 3).ऑटोक्लेव्ह केलेल्या नमुन्यांसाठी, नवीन शिखरे फक्त सोल्युशनमध्ये NaOH च्या उपस्थितीत शोधली जातात आणि शिखराची निर्मिती द्रावणातील NaOH एकाग्रतेवर अवलंबून असल्याचे दिसते (नमुने 5-8, तक्ता 3) (RRT = 0.79).आकृती 5 आयन क्रोमॅटोग्रामचे उदाहरण दर्शविते, NAOH च्या उपस्थितीत किंवा अनुपस्थितीत दोन ऑटोक्लेव्ह केलेले नमुने दर्शविते.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण.
टीप: शीर्ष क्रोमॅटोग्राम: नमुना 0.1% NaOH जलीय द्रावणाने हाताळला गेला आणि ऑटोक्लेव्ह (20 मिनिटांसाठी 120° से).तळाचा क्रोमॅटोग्राम: नमुना NaOH ने हाताळला गेला नाही, परंतु त्याच परिस्थितीत ऑटोक्लेव्ह केला गेला.LC-MS द्वारे 203.30/129.10 Da (सकारात्मक MRM मोडमध्ये) च्या वस्तुमान रूपांतरणाचे विश्लेषण केले गेले.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण.
सर्व ऑटोक्लेव्ह नमुन्यांमध्ये, NaOH सह किंवा त्याशिवाय, BDDE एकाग्रता मोठ्या प्रमाणात कमी झाली (16.6 पट पर्यंत) (नमुने 5-8, तक्ता 2).बीडीडीई एकाग्रतेत घट हे या वस्तुस्थितीमुळे असू शकते की उच्च तापमानात, 1,2-डायॉल कंपाऊंड तयार करण्यासाठी बीडीडीईच्या इपॉक्साइड रिंग उघडण्यासाठी पाणी बेस (न्यूक्लियोफाइल) म्हणून कार्य करू शकते.या कंपाऊंडची मोनोसोटोपिक गुणवत्ता BDDE पेक्षा वेगळी आहे आणि त्यामुळे त्याचा परिणाम होणार नाही.LC-MS ला 203.30/129.10 Da चे मास शिफ्ट आढळले.
शेवटी, हे प्रयोग दाखवतात की नवीन शिखरांची निर्मिती BDDE, NAOH आणि ऑटोक्लेव्हिंग प्रक्रियेवर अवलंबून असते, परंतु HA शी काहीही संबंध नाही.
अंदाजे 2.71 मिनिटांच्या धारणा वेळेत सापडलेले नवीन शिखर नंतर LC-MS द्वारे वैशिष्ट्यीकृत होते.या उद्देशासाठी, BDDE (9.9 mg/mL) 1% NaOH जलीय द्रावणात उष्मायन केले गेले आणि ऑटोक्लेव्ह केले गेले.तक्ता 4 मध्ये, नवीन शिखराच्या वैशिष्ट्यांची तुलना ज्ञात BDDE संदर्भ शिखराशी केली आहे (धारण वेळ अंदाजे 3.47 मिनिटे).दोन शिखरांच्या आयन विखंडन विश्लेषणाच्या आधारे, असा निष्कर्ष काढला जाऊ शकतो की 2.72 मिनिटांच्या धारणा वेळ असलेले शिखर बीडीडीई शिखरासारखेच तुकडे दर्शविते, परंतु भिन्न तीव्रतेसह (आकृती 6).2.72 मिनिटांच्या धारणा वेळ (PIS) शी संबंधित शिखरासाठी, 147 Da च्या वस्तुमानावर विखंडन झाल्यानंतर अधिक तीव्र शिखर दिसून आले.या निर्धारामध्ये वापरलेल्या BDDE एकाग्रतेवर (9.9 mg/mL), अल्ट्राव्हायोलेट स्पेक्ट्रममधील भिन्न शोषक मोड (UV, λ=200 nm) देखील क्रोमॅटोग्राफिक पृथक्करणानंतर (आकृती 7) आढळून आले.2.71 मिनिटांच्या धारणा वेळ असलेले शिखर अद्याप 200 nm वर दृश्यमान आहे, त्याच परिस्थितीत क्रोमॅटोग्राममध्ये BDDE शिखर पाहिले जाऊ शकत नाही.
सारणी 4 नवीन शिखराचे वैशिष्ट्यीकरण परिणाम सुमारे 2.71 मिनिटे आणि बीडीडीई शिखर 3.47 मिनिटांच्या धारणा वेळेसह
टीप: हे परिणाम प्राप्त करण्यासाठी, LC-MS आणि HPLC विश्लेषणे (MRM आणि PIS) दोन शिखरांवर केली गेली.HPLC विश्लेषणासाठी, 200 nm च्या तरंगलांबीसह UV शोध वापरले जाते.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एचपीएलसी, उच्च कार्यक्षमता लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण;m/z, वस्तुमान-ते-चार्ज गुणोत्तर;पीआयएस, उत्पादन आयन स्कॅनिंग;अतिनील प्रकाश, अतिनील प्रकाश.
टीप: वस्तुमानाचे तुकडे LC-MS विश्लेषण (PIS) द्वारे प्राप्त केले जातात.शीर्ष क्रोमॅटोग्राम: BDDE मानक नमुना तुकड्यांचे मास स्पेक्ट्रम.तळाचा क्रोमॅटोग्राम: नवीन शिखराचा वस्तुमान स्पेक्ट्रम आढळला (BDDE शिखराशी संबंधित RRT 0.79 आहे).BDDE 1% NaOH सोल्यूशनमध्ये प्रक्रिया केली गेली आणि ऑटोक्लेव्ह केली गेली.
संक्षेप: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl इथर;एलसी-एमएस, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री;MRM, एकाधिक प्रतिक्रिया निरीक्षण;पीआयएस, उत्पादन आयन स्कॅन;RRT, सापेक्ष धारणा वेळ.
आकृती 7 203.30 Da precursor ion चा आयन क्रोमॅटोग्राम, आणि (A) 2.71 मिनिटांच्या धारणा वेळेसह नवीन शिखर आणि (B) 200 nm वर 3.46 मिनिटांवर BDDE संदर्भ मानक शिखराचा UV शोध.
उत्पादित केलेल्या सर्व क्रॉस-लिंक्ड HA हायड्रोजेलमध्ये, असे आढळून आले की LC-MS परिमाणीकरणानंतर अवशिष्ट BDDE एकाग्रता <2 ppm होती, परंतु विश्लेषणामध्ये एक नवीन अज्ञात शिखर दिसून आले.हे नवीन शिखर BDDE मानक उत्पादनाशी जुळत नाही.BDDE मानक उत्पादनाने देखील सकारात्मक MRM मोडमध्ये समान गुणवत्ता रूपांतरण (MRM रूपांतरण 203.30/129.10 Da) विश्लेषण केले आहे.सामान्यतः, हायड्रोजेलमध्ये बीडीडीई शोधण्यासाठी क्रोमॅटोग्राफीसारख्या इतर विश्लेषणात्मक पद्धतींचा वापर मर्यादा चाचण्या म्हणून केला जातो, परंतु कमाल शोध मर्यादा (LOD) 2 ppm पेक्षा थोडी कमी असते.दुसरीकडे, आत्तापर्यंत, क्रॉस-लिंक केलेल्या HA उत्पादनांच्या साखर युनिटच्या तुकड्यांमध्ये क्रॉस-लिंकिंग आणि/किंवा HA च्या बदलाची डिग्री वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी NMR आणि MS वापरले गेले आहेत.आम्ही या लेखात वर्णन केल्याप्रमाणे (आमच्या LC-MS पद्धतीचा LOD = 10 ppb) इतक्या कमी सांद्रतेवर अवशिष्ट BDDE शोध मोजणे हा या तंत्रांचा उद्देश कधीच नव्हता.
पोस्ट वेळ: सप्टेंबर-०१-२०२१